洗碗精之家

　　本文介紹學生時期上組培課時的成果，當時老師要求同學們選一種作物，而且在學期結束前生出100棵組培苗來（當然初代的培植體不可用太多），到底什麼作物可以在短時間內增殖呢？感謝作麒麟花的俊源大大提供建議，最後選擇麒麟花作為材料。本文以較淺顯的方式介紹麒麟花組培原理和過程，也有些當時不熟練而犯下的錯誤，可以提醒各位不要再犯一樣的錯。

基本介紹：

　　麒麟花，大戟科大戟屬，學名Euphorbia milli（小花品系），英文名Crown of Thorns，是個花很可愛全身有刺的植物，不過現在也陸續育出無刺品種了。可採用扦插、嫁接、種子以及這邊要介紹的組織培養等方法繁殖。麒麟花的花為花序，外觀看起來像花的部分其實是苞葉，真正的花是中間那一坨。苞葉基部有芽點，第一層花開後，花芽逐漸從苞葉與花的交界中伸出，長成第二層，第二層以此類推長出第三層，看起來就是一層疊一層的花了！根據文獻的定義，第一層花未開時為immature stage（未成熟階段）、第一層花開時稱為1^st stage（第一階段）、第二層花開就稱為2^nd stage（第二階段），以此類推。組培時不同階段的花芽效果有差，一般建議取immature~1^st stage的花作材料。 方法：
　　麒麟花組織培養可透過癒傷組織誘導（取子房或花梗），其變異率較高，適合用於育種；或誘導芽體萌發（取莖頂或花序），優點是穩定性較高，可以生產均一的種苗，此處介紹的是利用花芽誘導為葉芽的方法進行組織培養。取用花芽的目的為消毒容易，而且一棵麒麟花可開出許多花序，比起取莖頂來說，摘除花序對於母體的傷害較小，又可持續摘花。根據卜莎蒂2008年的文獻指出，以花序組培大量繁殖之麒麟花單株成本為1.4~1.5元，可見以組織培養大量繁殖麒麟花具有極佳的商業潛力。

原理：
　　利用激素使原本欲進行生殖生長的花芽逆分化為營養生長的葉芽，讓葉芽長出新植株。在組織培養的處理中，經常使用生長素（Auxin）及細胞分裂素（Cytokinin），前者可誘導不定根，後者誘導不定芽，因此麒麟花組培時先使用細胞分裂素來誘導葉芽，激素的其他功能此處不多加贅述。

材料：
　　小花麒麟花，白花及紅花品種，詳細栽培種名稱不明，取immature與stage 1^st花序。

↓實驗農場外面的一大叢，材料很容易取得
  

過程說明：

1.2010.09.29 初代培養

目的：誘到花芽逆分化形成葉芽，進而長出shoot。
方法：取下花朵，以1%次氯酸鈉消毒5~10分鐘後，無菌水清洗三次，種於試管中。
配方：½ MS + 5 ppm BA, 3% sucrose, 1% agar, pH 5.7

↓將花苞基部插入培養基即可
  
↓過幾天會看到花開了，也有些被汙染（右圖）。

↓2010.11.04 一個多月後可觀察到新芽抽出，也有些褐化死亡（右下圖箭頭處）。

2.2010.11.08第一次繼代

目的：增殖。
方法：以解剖刀切下芽體，種入含繼代培養基之試管中。
配方：½ MS + 2 ppm BA, 3% sucrose, 1% agar, pH 5.7

↓2010.11.08剛切下
 

↓約2~3週後每個培殖體可產生3~5個芽不等。但培殖體與培養基交界面產生大量callus（右上圖箭頭處），老師表示：「切的技術不好」

3.2010.11.25第二次繼代

目的：繼續增殖。
方法：以解剖刀切下芽體，種入含繼代培養基之蘭花瓶中。
配方：同第一次繼代。

↓此為俊源大大的產品，本人用蘭花瓶結果拍得很醜…

4.2011.01.02出瓶

目的：出瓶馴化。
方法：取出組培苗，將糾纏在一起的苗切開，切除癒傷組織或洗淨根系，沾發根粉插入育苗海綿，以1/2 MS養液澆灌。

↓組培苗有好有壞，左上很妥當；右上長在癒傷組織上很糟糕，移出後要切除癒傷組織以免影響發根；左下竟然開花了；右下包含根系，需洗去上面殘留的培養基以免發霉，但清洗時又可能傷根，有些作法是不洗直接埋入土中，也有說法認為有些植物瓶內根系功能不健全，乾脆直接砍掉地下部，把地上部插進土中重新發根。
 

↓沾取發根粉

↓種入育苗海綿，放入箱中保濕（或直接放置霧床），現在想想我真是吃飽太閒，直接種土就好種什麼海綿…

↓長大後的樣子

討論：

1. 發霉問題：選用immature的花序汙染率較低，因為花朵還未開，可避免空氣中的灰塵進入。另外剛開始用了過期的漂白水，導致全軍覆沒…。
2. 以1%次氯酸鈉消毒5或10分鐘對於汙染率沒有明顯影響。
3. 繼代過程中常可看到大量癒傷組織，跟切的技術不好也有關係，切下芽體時傷口過多，BA在切口處累積，無法抵達芽體，而麒麟花內生Auxin濃度高，推測Auxin與Cytokinin拮抗之下產生癒傷組織，進而導致切口處癒傷組織大量生長，老師建議採雙層培養，可以改善吸收不良的問題。
4. 本次組培採用0.5或5 ppm BA進行誘導，發現0.5 ppm BA即可誘導芽體分化，初代36天後共22管長出芽體，只有一管褐化；然而採用5 ppm BA處理者，約2周褐化率即達80%以上，且最終只有2~3管產生芽體，對照前面同學的組培資料，同樣發現極高的褐化率，顯示高濃度BA容易造成培殖體死亡。然而前人研究皆採高濃度處理，可能與誘導速度和季節有關，尚待進一步研究。麒麟花花序本身即帶有生長點，誘導生長點產生芽體，相較於無生長點的組織誘導芽體要來得簡單得多，也許根據生長季節不同，可以在生長點萌動的時期減少BA濃度。
5. 本文的拍照技術並不及格，好孩子不要學，若能利用黑絨布配合固定器（或黏土）和燈光，可以拍出更美麗的照片。
6. 一般來說，組培苗經Cytokinin誘導長芽後，還需要利用Auxin誘導發根，然而麒麟花內生Auxin濃度相當高，不需添加額外的Auxin即可自行發根。

↓麒麟花在未添加Auxin的培養基中也可以長出許多根系。

文末附上：
　　麒麟花苞葉基部芽點的電子顯微鏡照片，材料為immature~1^st stage，不確定為花芽或葉芽。很幸運地，該課程除了組培之外，也讓學生有機會操作電子顯微鏡。不過1mm左右的麒麟花組織經過層層固定、脫水、乾燥、鍍金的複雜程序折磨（同時折磨我的眼睛和可憐的標本），還沖掉、吸掉、流掉好幾個後，我開始懷疑那些黏上平台，看不出原先樣貌的小渣渣到底是標本還是滴管中卡著的碎屑了，所以當後來其中一個標本竟然拍出清楚的芽點時，真是讓我有點佩服自己了…。平常用眼睛幾乎無法看見的小小芽點，其實長得很漂亮唷T▽T/

對麒麟花組培有興趣的話可以參考相關文獻：

1. 卜莎蒂。麒麟花利用花序培殖體之微體繁殖。中興大學研究所碩士論文。2008。（這篇內文是英文）（大綱）
2. Fascella, G. and G. Zizzo. Efficient propagation technique of Euphorbia x lomi Thai hybrids. 2009. Hortscience. 44(2): 495-498（大綱）
3. Xu, B., W. Dai and W. S. Chao. An efficient method for in vitro regeneration of leafy spurge ( Eupho rbia esula L.). 2008. In Vitro Cell. Dev. Biol. –Plant. 44: 548-556（全文PDF）
4. Y. H. Dewir, D. Chakrabarty, E. J. Hahn and K. Y. Paek. 2005. Reversion of inflorescence development in Euphorbia millii and its application to large-scale micropropagation in an air-lift bioreactor. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 80(5): 581–587（大綱）

　　謝謝收看！

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